大豆异黄酮分离提取检测方法

　　异黄酮是一类主要存在于大豆、具有重要生物活性的黄酮类化合物。许多研究表明，异黄酮具有抗氧化、抗真菌和雌激素样活性以及通过抑制酪氨酸蛋白酶或DNA拓扑异构酶的抗癌功效。在亚洲，大豆产品如豆腐和豆浆已成为大众食品，但异黄酮的种类和含量能在生产加工过程中发生改变，如大豆中主要异黄酮6’-O-丙二酰染料木苷或6’-O-乙酰染料木苷，这些转变能影响大豆食物的营养价值和生理功能，加之大豆化合物临床前研究的需要，具有专属和灵敏的测定各种大豆异黄酮分离提取的方法，多有报道。

　　异黄酮化合物过滤分离技术的分析方法有GC-MS、LC-UV、LC-MS等，GC-MS方法费时，又需先进行化学衍生，所以应用较少。应用较多的是LC-UV和LC-MS，HPLC法一般采用甲醇-水或乙腈-水，用三氟乙酸或乙酸为调节剂的梯度系统，作为流动相。

　　1、高效液相色谱(HPLC)

　　研究改进了乙腈-水梯度系统，快速分析12种大豆异黄酮的HPLC法：色谱柱选用Vydac201TP54C18柱(250mm×4.6mmID，5μm)，流动相为乙腈(A)和水(B)梯度洗脱：初始0min为8%A，2min10%A，3min12%A，10min22%A，11min23%A，12min35%A，保持3min，至20min返回至8%A，流速2ml/min，柱温35℃，检测262nm，Formononetin(刺芒丙花素：7-羟(基)-4’-甲基异黄酮)用作内标。大豆异黄酮分离提取方法：大豆冰冻干燥，磨成细粉，100g粉加己烷300ml振荡30min，离心弃去上清液，残渣用己烷30ml重复提取和离心3次后，挥干溶剂。脱脂大豆粉0.5g加丙酮-0.1mol/LHCl(5∶1，v/v)5ml，室温下振荡2h，离心，上层溶液收集于烧杯中蒸干，加浓度为200μg/ml的内标。

　　用甲醇稀释大豆异黄酮分离提取方法：大豆冰冻干燥，磨成细粉，100g粉加己烷300ml振荡30min，离心，弃去上清液，残渣用己烷30ml重复提取和离心3次后，挥干溶剂。脱脂大豆粉0.5g加丙酮-0.1mol/LHCl(5∶1，v/v)5ml，室温下振荡2h，离心，上层溶液收集于烧杯中蒸干，加浓度为200μg/ml的内标(125μl)用甲醇稀释至5ml，使内标的浓度为5μg/ml，0.2μm滤膜过滤，进样20μl。

　　2、提取、分离、纯化技术

　　许多研究者研究了不同的大豆异黄酮分离提取溶剂的提取效率，其中包括含有一定比例水或酸性水的乙腈、甲醇、乙醇和丙酮溶液。研究了乙腈、丙酮、乙醇和甲醇在提取5种不同食物基质，包括大豆粉、组织化植物蛋白(texturized vegetable protein,TVP)、豆腐、印尼豆豉(tempeh)和大豆胚芽中的12种异黄酮的提取效率，提取溶剂包括加或不加0.1mol/LHCl，含有47%水的有机溶剂。提取溶剂的配制方法为：有机溶剂10ml，加水2ml或0.1mol/LHCl2ml，再加水7ml。结果表明：

　　①实验选择的食物基质中，异黄酮种类的分布有很大差别，大豆粉、豆腐、印尼豆豉和TVP含有的丙二酰-β-葡萄糖苷，分别约为80%、37%、35%和50%，大豆芽的总异黄酮浓度高于其他大豆食品的6～10倍，主要的异黄酮为β-葡萄糖苷类约含总量的50%。

　　②乙腈对这些大豆食品异黄酮的大多数是较好的提取溶剂。对于大豆粉，仅甲醇对苷元的提取率好于乙腈，但其所含的苷元只占总黄酮的3%。豆腐、TVP和印尼豆豉的苷元浓度较高，乙腈对苷元的提取率与其他溶剂一样有效。丙酮作为提取溶剂几乎与乙腈同样好，但有例外；乙醇的提取效率低于乙腈，而甲醇差。