异黄酮是一类主要存在于大豆、具有重要生物活性的黄酮类化合物。许多研究表明,异黄酮具有抗氧化、抗真菌和雌激素样活性以及通过抑制酪氨酸蛋白酶或DNA拓扑异构酶的抗癌功效。在亚洲,大豆产品如豆腐和豆浆已成为大众食品,但异黄酮的种类和含量能在生产加工过程中发生改变,如大豆中主要异黄酮6’-O-丙二酰染料木苷或6’-O-乙酰染料木苷,这些转变能影响大豆食物的营养价值和生理功能,加之大豆化合物临床前研究的需要,具有专属和灵敏的测定各种大豆异黄酮分离提取的方法,多有报道。
异黄酮化合物过滤分离技术的分析方法有GC-MS、LC-UV、LC-MS等,GC-MS方法费时,又需先进行化学衍生,所以应用较少。应用较多的是LC-UV和LC-MS,HPLC法一般采用甲醇-水或乙腈-水,用三氟乙酸或乙酸为调节剂的梯度系统,作为流动相。
1、高效液相色谱(HPLC)
研究改进了乙腈-水梯度系统,快速分析12种大豆异黄酮的HPLC法:色谱柱选用Vydac201TP54C18柱(250mm×4.6mmID,5μm),流动相为乙腈(A)和水(B)梯度洗脱:初始0min为8%A,2min10%A,3min12%A,10min22%A,11min23%A,12min35%A,保持3min,至20min返回至8%A,流速2ml/min,柱温35℃,检测262nm,Formononetin(刺芒丙花素:7-羟(基)-4’-甲基异黄酮)用作内标。大豆异黄酮分离提取方法:大豆冰冻干燥,磨成细粉,100g粉加己烷300ml振荡30min,离心弃去上清液,残渣用己烷30ml重复提取和离心3次后,挥干溶剂。脱脂大豆粉0.5g加丙酮-0.1mol/LHCl(5∶1,v/v)5ml,室温下振荡2h,离心,上层溶液收集于烧杯中蒸干,加浓度为200μg/ml的内标。
用甲醇稀释大豆异黄酮分离提取方法:大豆冰冻干燥,磨成细粉,100g粉加己烷300ml振荡30min,离心,弃去上清液,残渣用己烷30ml重复提取和离心3次后,挥干溶剂。脱脂大豆粉0.5g加丙酮-0.1mol/LHCl(5∶1,v/v)5ml,室温下振荡2h,离心,上层溶液收集于烧杯中蒸干,加浓度为200μg/ml的内标(125μl)用甲醇稀释至5ml,使内标的最后浓度为5μg/ml,0.2μm滤膜过滤,进样20μl。
2、提取、分离、纯化技术
许多研究者研究了不同的大豆异黄酮分离提取溶剂的提取效率,其中包括含有一定比例水或酸性水的乙腈、甲醇、乙醇和丙酮溶液。最近研究了乙腈、丙酮、乙醇和甲醇在提取5种不同食物基质,包括大豆粉、组织化植物蛋白(texturized vegetable protein,TVP)、豆腐、印尼豆豉(tempeh)和大豆胚芽中的12种异黄酮的提取效率,提取溶剂包括加或不加0.1mol/LHCl,含有47%水的有机溶剂。提取溶剂的配制方法为:有机溶剂10ml,加水2ml或0.1mol/LHCl2ml,再加水7ml。结果表明:
①实验选择的食物基质中,异黄酮种类的分布有很大差别,大豆粉、豆腐、印尼豆豉和TVP含有的丙二酰-β-葡萄糖苷,分别约为80%、37%、35%和50%,大豆芽的总异黄酮浓度高于其他大豆食品的6~10倍,主要的异黄酮为β-葡萄糖苷类约含总量的50%。
②乙腈对这些大豆食品异黄酮的大多数是较好的提取溶剂。对于大豆粉,仅甲醇对苷元的提取率好于乙腈,但其所含的苷元只占总黄酮的3%。豆腐、TVP和印尼豆豉的苷元浓度较高,乙腈对苷元的提取率与其他溶剂一样有效。丙酮作为提取溶剂几乎与乙腈同样好,但有例外;乙醇的提取效率低于乙腈,而甲醇最差。
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